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Métodos de Coloração Bacteriana

última atualização: 22/04/01 

  

 

Coloração de Gram (diferencial)

Processo de coloração e as bases quimico-estruturais dos resultados.

A forma mais comum de classificação de bactérias é através do método de gram, podendo ser: coloração de GRAM positiva ( GRAM + )

ou GRAM negativa (GRAM -).

processo da coloração de GRAM:

a . violeta de Ginciana (mínimo de 1 min)

b . lugol (Iodo + Iodeto K) - mínimo 1 min

c . agente diferenciador: álcool + acetona

        em algumas células o agente diferenciador não consegue penetrar: a célula  continua azul. (B)

        em algumas células o agente diferenciador consegue penetrar retirando a coloração azul.(A)

d . safranina ou fuccina diluída: contracoloração . Bactérias A agora se coram em vermelho / rosa e com as bactérias B não acontece nada, continuando azuis.

Desta forma, podemos resumir o resultado da coloração de GRAM em duas formas:

• bactérias GRAM positivas: ficam azuis, pois não permitem a entrada do agente diferenciador.

• bactérias GRAM negativas: ficam vermelhas, pois permitem entrada do agente diferenciador.

Nota - Parede celular: formada por camadas múltiplas externamente à membrana plasmática. Há uma camada mais interna que é composta por peptideoglicana envolta por uma camada mais externa (varia espessura e composição química). A peptideoglicana confere resistência a meios de baixa pressão osmótica como a água, sendo responsável pelo suporte estrutural e também mantém a forma característica da bactéria. A peptideoglicana é um açúcar com grupos amina sendo uma esrtutura estável.

Diferenças entre as paredes das bactérias GRAM positivas e GRAM negativas:

• GRAM positivas:

    - camada de peptideoglicana é mais espessa e algumas também possuem uma camada de ácido teicóico externa à camada de peptideoglicana.

Nota - ácido teicóico: é uma estrutura anti-gênica importante, reconhecida pelo sistema imune (induz formação de anticorpos espécie - específicos). São encontrados na camada externa da parede celular de GRAM +. Alguns polímeros de ácido teicóico penetram através da camada de peptideoglicana, ligando-se covalentemente aos lipídeos da membrana citoplasmática, sendo agora denominada de ácido lipoteicóico, enquanto outros se ligam ao ácido murâmico da peptideoglicana.

• GRAM negativs:

    - camada externa composta por lipopolissacarídeos, lipopoliproteínas e fosfolipídeos. Há o espaço periplasmático - entre membrana citoplasmática e camada de peptideoglicana - que em alguma espécies contém B - lactamases (degrada penicilina ) e B - lactâmicas.

    - tem parede mais fina, porém mais complexa.

    - possui endotoxinas (lipopolissacarídeos).

    - deixa entrar agente diferenciador porque tem lipídeos. GRAM + não.

considerações importantes

• Algumas bactérias são pleomórficas em relação à coloração GRAM, logo se coram irregularmente.

• A lisozima ataca paredes de bactérias GRAM positivas, havendo uma forma involutiva. A lisozima se encontra nas lágrimas, suor e saliva e consegue romper o esqueleto da peptideoglicana, permitindo que exista uma resistência natural do hospedeiro à infecção bacteriana.

• Estreptococos produzem autolisinas que ficam na sua parede, permitindo a entrada do agente diferenciador. Com isso, a bactéria apresenta coloração GRAM negativa devido à forma de involução.

• Propriedade tintorial: é qualificar a bactéria em GRAM positiva ou GRAM negativa.

• Bactérias GRAM positivas podem se tornar GRAM negativas ao sofrer uma modificação em sua membrana.

• Bactérias tratadas com lisozima perdem sua parede, mas se forem tratadas em um meio à mesma pressão osmótica que seu interior ficam arredondadas -  esferoplastos e os protoplastos.

• Bactérias GRAM negativas não pode se tornar GRAM positivas.

• Forma L: são as GRAM negativas ou GRAM positivas que perdem suas paredes.

• Bactérias GRAM positivas são mais susceptíveis à penicilina G do que as GRAM negativas.

Nota: As proteínas porinas têm importante função na regulação do transporte de pequenas moléculas hidrofílicas para o interior da célula. Formam trímeros, funcionando como um canal inespecífico.


Coloração de bacilos álcool - ácido resistentes (Ziehl Neilsen)

1 . Mycobacterium:

As Mycobacterium não se coram com GRAM pois sua parede é diferente da parede de bactérias GRAM positivas e GRAM negativa. A parede das Mycobacterium são grossas com grande quantidade de lipídeos - ácido micólico (60% da parede). Tal estrutura resulta em paredes impermeáveis.

2. Processo da coloração

• Fucsina concentrada com aquecimento (mais ou menos 10 min): precisa aquecer, pois corante não entra facilmente por causa da parede grossa.

• Álcool + ácido: agente diferenciador não entra nas Mycobactérias. Álcool-ácido é mais forte que álcool-acetona.

• Contracoloração: azul de metileno (fraco).

• Resultado: bactérias álcool resistentes ficam vermelhas e as outras azuis.

• Esquema da parede das GRAM positivas e GRAM negativas:

    GRAM positivas:

                            cápsula

                            peptideoglicana

                            /////////////////// membrana citoplasmática

 

    GRAM negativas:

                                  camada externa (LPS)      

                                                              peptideoglicana

                           Espaço periplásmico

                                 ////////////              membrana citoplasmática

• LPS: é endotoxina (é parte integral da célula, ao contrário das exotoxinas que são secretadas pela bactéria) sendo responsável por muitos dos sintomas das doenças (ex: choque, febre, etc)

• Parede da GRAM negativa (sequência de cima para baixo):

                            LPS (lipídeo - polissacarídeo) camada

                            Camada bilipídica externa

                            Proteínas lipo (acúmulo de enzimas hidrolíticas)

                            Camada fina (2 a 8nm) de peptideoglicana

• Diferenciação da GRAM negativa: o polissacarídeo.


 

Referências Bibliográficas

1. Microbiologia; terceira edição; Luis Trabulsi, Flávio Alterthum, Olga Gompertz, José Alberto Candeia; editora Atheneu;1999

2. Microbiologia médica; décima oitava edição; Ernest Jawetz,George Brooks, Joseph Melnick,Janet Butel,Edward Adelberg, L. Nicholas Ornston; editora guanabara koogan

 

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Autores

Equipe EstudMed.com


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